Purification de la dextrinase limite du cultivar de sorgho Safrari (Sorghum bicolor L. Moench) (2020)
Il a été question dans cette thèse de purifier la dextrinase limite du sorgho Safrari. Cette enzyme étant synthétisée dans cette céréale pendant le maltage, il s’est agit plus précisément dans un premier temps d’effectuer un criblage préalable des facteurs qui influencent la synthèse des enzymes amylolytiques en général pendant le maltage, suivi de la maximisation de la production de la dextrinase limite en particulier avec le temps de germination. Dans un deuxième temps, la méthodologie des surfaces de réponses a servi à l’optimisation des conditions d’extraction de la dextrinase limite à partir du malt obtenu. Et enfin, la purification a consisté en la maximisation de la précipitation de la dextrinase limite au sulfate d’ammonium suivi de la dialyse. L’expérimentation menée à l’issu de ces objectifs a permis d’obtenir une synthèse optimale de la dextrinase limite dans le sorgho Safrari au bout de 5 jours de germination à 25 °C, ceci étant précédé d’un trempage continu des grains dans une solution de NaOH à 0,1 % pendant 24 h à 25 °C, avec changement de la solution de trempage après 12 h. Le plan de Doehlert utilisé pour l’optimisation de l’extraction à partir du malt vert (avec ses radicelles) précédemment obtenu a conduit à 10 h d’extraction à 23 °C dans un tampon acétate de sodium à 100 mM et pH 5,0, pour un ratio masse/volume de 5/32. Au cours de la purification, l’activité spécifique de la dextrinase limite s’est avérée maximale à un taux de saturation au sulfate d’ammonium de 20 % masse/volume. Une étude comparative des caractéristiques de la dextrinase limite par des tests d’activité au pullulan naturel d’une part, et au kit Megazyme K- PullG6 d’autre part, a montré que la précipitation au sulfate d’ammonium suivie de la dialyse donnerait un extrait en dextrinase limite partiellement purifié, avec un rendement de 75 % et un facteur de purification de 6,5. A cet effet, la méthode de test d’activité de la dextrinase limite au kit Megazyme adaptée à de tels extraits de par sa haute spécificité, a été utilisée pour la caractérisation enzymatique: température optimale d’activité et de stabilité de 50 – 60 °C ; pH optimum d’activité et de stabilité de 5,0 – 5,5 ; la dextrinase limite est une enzyme sulfhydrile nécessitant la présence de dithiothréitol à 10 mM pour son extraction maximale et aussi, la présence d’agents réducteurs tels le dithiothréitol ou l’acide ascorbique pour une meilleure activité de l’enzyme purifiée. Par ailleurs, suite au même test, il en est ressorti que l’activité de la dextrinase limité est rehaussée en présence de chlorure de calcium ou de sérum albumine bovine. Ses paramètres cinétiques sur l’amidon ont été de 0,03 mg-1mL 1sec-1 pour la vitesse maximale (Vmax) et de 2,4 mg/mL pour la constante de Michaelis (Km). Enfin, l’application de l’extrait purifié sur des moûts de sorgho a conduit à l’augmentation des volumes cumulatifs des filtrats desdits moûts en fonction du temps. Les caractéristiques de la dextrinase limite du malt de sorgho Safrari lui permettent ainsi d’être utilisée dans des conditions modérées, et sur une plage relativement large de température et de pH dans les procédés de transformation enzymatique de l’amidon en générale, et dans l’industrie brassicole en particulier.
The aim of this thesis was to purify limit dextrinase from Safrari sorghum cultivar. Since this enzyme is synthesized in sorghum during the malting process, this study was specifically aimed at first using a screening experimental design to sort out factors which influence amylolytic enzymes synthesis in general during the malting process, followed by the maximisation of limit dextrinase synthesis and activity with the duration of germination. Secondly, the response surface methodology was used to optimise extraction conditions of limit dextrinase from the obtained malt. And finally, purification consisted at maximising the precipitation of limit dextrinase with ammonium sulfate, followed with dialysis. Experimentation led to the optimal synthesis of limit dextrinase during the malting process after 5 days of germination at 25 °C, preceded with continuous steeping in 0.1 % alkaline (NaOH) solution for 24 h at 25 °C, with the renewal of the steep solution after 12 h. The Doehlert design used for optimising the limit dextrinase extraction process led to the following optimum conditions: extraction for 10 h at 23 °C in sodium acetate buffer (100 mM), pH 5.0 with a ratio of malt mass (g) over buffer volume (mL) of 5/32. During the purification step, maximisation of ammonium sulfate precipitation gave a maximum specific limit dextrinase activity at 20 % m/v saturation. A comparative study of limit dextrinase characteristics using two different assay technics, one with natural pullulan as substrate and the other with synthetic substrate from the kit Megazyme K-PullG6, came to the conclusion that ammonium sulfate precipitation followed by dialysis led to a partially purified extract of limit dextrinase. The purification yield and the purification fold were 75 % and 6.5 respectively. Therefore, the assay method using the kit Megazyme for limit dextrinase, well adapted to such extract given its high specificity, led to the following characteristics of limit dextrinase: optimum temperature for limit dextrinase activity and stability: 50 – 60 °C; optimum pH of activity and stability: 5.0 – 5.5; limit dextrinase is a sulfhydryl enzyme which needs the presence of a reducing agents for its maximal extraction. In addition, reducing agents such as ascorbic acid or dithiothreitol enhance the activity of the purified enzyme. The activity of the purified limit dextrinase was also enhanced in the presence of calcium chloride or bovine serum albumin. Its kinetic parameters on starch were 0.03 mg- 1mL 1sec-1 for the maximum velocity (Vmax) and 2.4 mg/mL for Michaeli-Menten constant (Km). Cumulative volumes of sorghum wort filtrates were enhanced in the presence of added purified limit dextrinase. Limit dextrinase characteristics of Safrari sorghum cultivar showed that the enzyme can be exploited in moderate conditions on relatively large range of pH and temperature in enzymatic starch conversion processes in general, and the brewing industry in particular.
